与此同时，B-29 和轰炸机的机组人员的训练也再紧张进行。这项特别机组训练计划由保罗.W. 提贝兹上校指挥，提贝兹曾在欧洲和北非飞过 B-17，具有丰富的经验，并且直接参与了 B-29 的试飞工作。1944 年 9 月，提贝兹上校成为在犹他州温都华（wendover）新组建的第 509 混成大队指挥官，该大队只有一个轰炸机中队——第 393 中队，中队指挥官查尔斯.W.斯韦尼少校。第 509 混成团是一个完全自治的单位，拥有独立的运输、维修、后勤、通讯和警卫部队。由于曼哈坦计划的高度机密性，大队的官兵并不知道他们即将执行的任务。
1945 年春，第 509 混成大队派驻马里亚纳，并隶属于第 21 轰炸机司令部。7 月，509 大队的轰炸机与第 313 轰炸机联队一道部署在提尼安岛的北部机场。509 大队的轰炸机中有部分装备了寇蒂斯电动可逆桨螺旋桨，可以减少降落距离，另外这种螺旋桨桨叶的根部加宽，可以增加进入 R-3350 发动机的冷却气流。
抵达提尼安岛的“伊诺拉.盖伊”号
1945 年 7 月 16 日美国在新墨西哥州的阿拉莫戈多（Alamogordo）沙漠进行了人类历史上首次的核爆炸。刚接任总统的杜鲁门便在波茨坦会议上向斯大林吹嘘自己有巨大威力的炸弹，对方却全无反应，英国首相丘吉尔认为他根本听不懂。其实，斯大林比杜鲁门更早知道“曼哈顿计划”，苏联的同类研究也在 1943 年展开，核竞赛早已秘密开始。7 月 26 日，中美英苏发布了敦促日本无条件投降的波兹坦公报。
之前展出的“伊诺拉.盖伊”的机身段和螺旋桨，注意桨叶根部加宽的部分
美国政府已经决定在日本使用原子弹，这样将避免进行登陆战至少 50 万的巨大伤亡。7 月 24 日，太平洋战略航空军司令卡尔.A.斯帕茨被授权只要天气允许就使用 509 大队进行核攻击。首批目标定为广岛、小仓、新泻和长崎。7 月 31 日杜鲁门总统从波兹坦传来行动信号。
美国海军巡洋舰印第安那波里斯号在 7 月 26 日将“小男孩”的枪管和子弹组件运送到提尼安岛，“小男孩”铀靶组件的三个部分和“胖子”的引信和钚核由 C-54 机队运抵提尼安。“胖子”的引爆装置则由三架 B-29 从新墨西哥州的科特兰（Kirtland）机场运来，8 月 2 日原子弹全部运抵马里亚纳。
7 月 31 日，“小男孩”准备完毕。8 月 2 日，李梅将军的参谋部将广岛定为主要目标，小仓和长崎是备选目标。广岛被选中的原因是因为情报显示此处没有盟军战俘。
轰炸定在 8 月 6 日进行，提贝兹上校将亲自驾驶 B-29 投放原子弹。在任务前一天，他的飞机（马丁奥马哈工厂制造的 B-29-45-MO，序列号 44-86292）在机鼻漆上了 Enola Gay 的字样——提贝兹的母亲的名字。
提贝兹上校驾驶“伊诺拉.盖伊”号准备起飞轰炸广岛
三架 F-13A 侦察机在轰炸之前先行起飞侦察了作为主要目标和备选目标的三个城市的气象情况。一个小时之后，提贝兹的“伊诺拉.盖伊”号和两架伴随观测的 B-29 飞向广岛。在飞往日本的途中，提贝兹收到了先行起飞的“同花顺”（Straight Flush）号 F-13A 的克劳德.埃特里少校发来的无线电，报告广岛上空晴朗适合目视轰炸，海军武器专家威廉.帕森斯上尉随即将钻入炸弹舱进行原子弹的最后装配工作，原子弹处于待发状态。之所以这样做是出于安全考虑，如果在地面就将原子弹装配好，起飞时发生事故将会摧毁整个提尼安岛。
上午 8:15，“伊诺拉.盖伊”号在广岛上空 9,906 米投下了“小男孩”，原子弹上的引信爆炸高度设置在 600 米，在接下来的爆炸中，一座城市消失在闪光中……。
杜鲁门总统宣布对日本使用了原子弹。最初日本人并不知道到底发生了什么，东京与广岛之间通信不畅，无法了解情况。8 月 8 日下午，外相东乡在皇宫地下室晋见天皇，奏陈美国使用原子弹，但原子弹给日本统治上层阶级带来的影响并不像美国预期的那样强烈，甚至铃木首相原计划召开的最高战争指导会议因故也没举行。此时日本将结束战争的希望寄托在苏联，日本政府已指示驻苏大使佐藤与苏联外交部长莫洛托夫会谈，希望苏联出面斡旋，争取比较体面的投降。而日本国内由于严密的新闻封锁，广大人民对于原子弹也并不是知道的很清楚，所以造成的恐慌也没有预计的那样强烈与广泛。
在日本政府举棋不定之时，美国并没有停止 B-29 常规轰炸。来自第 58、73、313 轰炸机联队的 B-29 在第二天轰炸了封川兵工厂。8 月 7 日夜第 525 轰炸机大队的 B-29 在数个港口 171 吨水雷。8 月 8 日，第 58、73、313 联队的 B-29 使用燃烧弹轰炸了九州八幡市，同时第 314 队在轰炸了东京的一个工业区。日本防空部队仍然进行了抵抗，在八幡击落 4 架，东京击落 3 架 B-29。
由于日本官方反应平静，美国觉得有必要进行第二次原子弹轰炸。钚弹“胖子”装载进了“伯克之车”（Bock's Car）号 B-29（马丁奥马哈工厂制造的 B-29-35-MO，序列号 44-27297），以机长弗雷德里克.C.伯克的名字命名。但是在这次任务中，“伯克之车”由第 393 中队指挥官斯韦尼少校驾驶，伯克上尉飞另外一架观测机，此次的主要目标是小仓兵工厂，长崎是备选目标。
“伯克之车”号
8 月 9 日，“伯克之车”号载着原子弹起飞，由于小仓兵工厂被前一天轰炸八幡所产生的烟雾所笼罩，投弹手在三次通过时都无法找到瞄准，斯韦尼只能转向备选目标长崎。长崎上空也有云层覆盖，但在 B-29 第二次通过目标时投弹手终于在两块云之间的缝隙中发现目标，上午 11:00，“胖子”被投放，爆炸当量 2 万 2 千吨 TNT，有 35,000 日本人在瞬间死去。
返航途中，“伯克之车”号由于一个燃油泵故障在冲绳降落，在加了一些油后飞回提尼安。
同一天苏联宣布对日作战，出兵东三省。天皇授意内阁接受波兹坦公告无条件投降，但军队一些狂热的法西斯分子甚至考虑进行政变阻止投降。此时 B-29 并没有停止轰炸，8 月 14 日，有记录表明有 804 架 B-29 轰炸了日本各处的目标。8 月 15 日晨，天皇向日本全境广播了投降诏书，大多数日本人在此前从未听过他的声音。