在陈纳德提出新年计划之后不久，日军方面鉴于夏季以来美驻华空军力量的日益加强，意识到过去“一直采用的战斗轰炸机联合进攻”战术已不易取得成功，而对美空军在中国东南沿海及长江流域日本运输能力的打击又不能不有所考虑。因此从 11 月起，日军试图酝酿一个从根本上解决中国上空制空权计划，从而缓解赖以生存的运输问题。是月初，日军参谋本部杉山总长首先提出：“压制中国大陆的美空军拟有困难，……难道不能从华中和华南打通粤汉铁路，使美空军不得使用中国东南部的基地吗？”〔43〕11 月 25 日随着台湾新竹机场被袭击，更加快了日军酝酿新年作战的步伐。1 月初在华美空军配合美军潜艇在东海的活动，使得日方船只损失急剧上升。与此同时，杉山 11 月初提出的打通粤汉铁路的设想也趋于成熟，并于 1 月 24 日获得日本天皇的批准。这样日本在中国大陆最后的一次大规模行动计划——一号作战计划就出笼了。其目的主要是一方面消灭在华美空军，另一方面打通粤汉铁路从而使贯穿中国的铁路联接起来，以便运送物资与兵力，支持在东南亚的日军。为此目的，日军计划使用 10 多个步兵师团及第五航空军的两个师团作战。
当日军一号作战计划出笼时，盟军方面尚一无所知。第十四航空队也一直继续着上年底的活动。然而日军在黄河故道曲折处与沿长江的集结与推进，逐渐引起第十四航空队的注意。陈纳德一方面开始向史迪威发出警告，认为日军在河南的部署是珍珠港事件以来最危险的，并建议 5 月空运 8,000 吨物资到中国，成立预备空军等；一方面派出轰炸机沿长江的日军集中区，对长江的船只、九江和岳阳一带的交通线进行轰击。3 月日军的调动目的已非常明显，陈纳德便开始制定作战计划与进行准备工作。首先命令中美混合空军大队四个战斗机中队和一个中型轰炸机队进驻梁山、恩施、汉中、安康等川陕一带的机场，试图日军在过黄河之前先将黄河铁桥炸毁，然而陈纳德的工作尚未完成，尚在呼吁予第十四航空队与中美空军以适当增援时，日军已先于 4 月 17 日拉开了一号作战计划中河南会战的战幕（亦即豫湘桂战役的战幕）。具有讽刺意味的是，就在同一天，史迪威还要求第十四航空队的第一任务是保卫成都的 B-29 轰炸机。
为配合日军地面部队的进攻，日空军在新乡、运城、彰德等地集结了 90 余架飞机，对中国军队的阵地进行轰炸。仅 4 月 19 日，日军就出动飞机 200 架次以上，对中国军队进行数十次的俯冲轰击，制空权全被日军掌握。直到战事进行 11 天时，美中空军才开始出击黄河铁桥，但由于此时日军早已有了几座代用桥梁，出击根本不能阻挡日军的进攻。就在这天晚上日军开始了攻打许昌的战斗。进入 5 月后，随着准备工作的基本就绪，美战斗机才开始在战场上活跃起来，并取得一定成果。以 5 月 5 日为例，据史迪威总部战报，美战斗机掩护轰炸机炸信阳铁路工场及仓库，掷弹 80% 命中目标，毁货车 40-50 辆，军用坦克颇多，敌军伤亡之人数约 300 到 400 人〔45〕。5 月中旬，鉴于战况的发展，史迪威开始同意将汽油与在成都的 P-47 飞机供给陈纳德。但此时，河南作战已接近尾声。日军已着手一号作战第二阶段——湖南会战的准备工作。
根据会战前东条英机给日本天皇的奏章，这次会战针对在华美空军的意图更加明确。东条英机希望“依靠本作战将摧毁敌方在衡阳、桂林、遂川附近的主要空军基地，……钳制驻华美空军的活动，以保卫皇国疆土的安全”〔46〕。因此，侵华日空军从 5 月 17 日起便先派出机队对美军基地进行轰炸；次日第五航空军的战斗司令部也由南京迁至汉口。足见其重视的程度。
5 月 27 日湖南会战开始，日军先锋直抵长沙，并于 6 月 18 日加以攻占。在此过程中，第十四航空队各方面遇到极大的困难。在作战飞机上，由于有 350 架用在怒江方面作战及保卫成都的 B-29 基地，结果在东线仅有 150 架防守，而其中真正能出击的才 90 架飞机；全面出动的物资则只准备了 30 天；更具戏剧性的是，就在日军发动湖南进攻的同一天，史迪威还要求马歇尔解除陈纳德的指挥权；再者，这时两湖地区气候状况也很糟。即使如此，从 6 月初起，美机仍在战场上频繁出击，出击最多时达每日 50 架次，对敌机场、舰艇、部队及设施进行了富有成效的攻击。但是，最终未能阻挡日军的南进。长沙陷落后日军继续向衡阳进攻。在强大的压力下，美军只好在 6 月 26 日放弃在华东的第一个前进基地——衡阳机场。
7 月初，尽管日军在陆上进展顺利，但是在空中美机力量却有急剧增加的迹象，加之天气好转，美机出动架次增加，给日方后勤供应线造成极大的困难。据杉山战后回忆，由于第十四航空队袭击与洪水，从汉口南下的铁路被毁，不能修复。在初攻衡阳失败前，没有物资供应日军。7 月 2 日也只有少量的物资送到前线日军〔47〕。
但在此关键时刻，尽管“美空军的斗志极为旺盛”，美空军的汽油供应却开始严重短缺。7 月的第一周里陈纳德只好命令 B-24 轰炸机回飞昆明；到 7 月 13 日汽油短缺更加严重，桂林、柳州两基地共有汽油 1.25 万吨；17 日为避免受到袭击，不少飞机也飞回昆明。有五天之久，美机不能起飞，唯一能升空作战的是在浙江的第五战斗机大队 P-40 战斗机。这样美空军不但丧失了在关键时刻支援中国地面部队的机会，而且遭到日本空军的攻击。7 月 23 日日空军第 90 战队转到广东，主要攻击目标为桂林、柳州美军基地。同一天日军在对零陵机场的攻击中，毁美机 18 架。28 日对柳州的袭击中美机损失为 36 架。其后日机还连续对芷江、桂林等机场袭击，直至 8 月 5 日。与此同时日军地面部队在飞行队的协助下加紧了对衡阳的攻势，当在充足的汽油运送到美军前进基地时，日军已于 8 月 8 日攻下了衡阳城。
衡阳失守后，华东局势更加严峻。这时美空军在获得补充后，再次回到东线作战，对日军的轰炸异常猛烈。据日军自己估计，8 月中旬华中方面美机来袭有 1,000 多架次，共 171 回。这些行动最终使美机掌握了战场上的制空权。8 月 29 日，日军在获得补充之后，从衡阳继续南下。美空军在此后一段时期里的活动，主要是以空袭来阻挡日军，并取得一定成绩。9 月 4 日，日军 58 师团在白地市附近多次遭到美机袭击，日军承认“使部队前进受阻，而且受到相当损害”〔48〕。同日在祁阳的日军第 13 师团因空袭各队均受损伤。5 日，美机继续对上述两个师团轰炸扫射，致使 58 师团只能在夜间行军，第 13 师团的转移也发生困难。不过，美机的这些轰击虽然能暂时延缓日军的进军速度，却不能从根本上影响战局。9 月 6 日日军占领美机在东线的又一重要基地——零陵机场。