为了进行“巨人”的实用测试，从担任空降作战的第 9 航空军中为“华沙南”计划抽调人员，编成拉普汉姆特殊分遣队。其中有很多参加过 滑翔机实战的滑翔机飞行员和曳航机驾驶员。2 月 25 日的试飞由梅塞史米特公司的鲍尔操纵，全机总重 14,880 千克。以后的试飞由分遣队员进行，有名的女飞行员也参加过 5 次试飞。原型 2 号机在 3 月 24 日的首次试飞时发生紧急事故，鲍尔在两分钟内中止飞行迫降着陆。
由 He 111Z 拖曳的 Me 321 滑翔机
Me 321 在运用上最大问题是曳航的 Ju 90 的动力不足，难以胜任曳航任务。由乌德特将军提议专门设计的亨克尔 He 111Z（由两架 He 111 并联的五发机） 还正在研制。在此之前只有采用由 3 架 Bf 110C 双发重型战斗机曳航一架 Me 321 的“三驾马车”方法，同时按设计 Me 321 还要使用以过氧化氢为燃料的起飞助飞火箭（6～8 个推力 550 千克或 4 个推力 750 千克或两个推力 1,000 千克的） ，它们悬挂在 Me 321 主翼支柱外侧的中翼下方，起飞后投弃回收可再次灌装燃料使用。但这种火箭性能不稳定，起动时间不一，效果不佳，可又不能不用。Me 321 着陆滑降速度 140 千米／小时时，要在地面滑行 400 米以上，为缩短着陆滑行距离还要使用大型条带形减速伞。
利用火箭助推器起飞的 Me 321
用 3 架 Bf 110 曳航一架 Me 321 其危险性不难想像。曳航索为直径 10 毫米的钢索，3 架 Bf 110 成“品”字形，先导机使用的曳航索长 100 米，左右两机的曳航索长 80 米。当 3 架曳航机起动时，巨人的起飞助飞火箭也开始点火，起飞至少需要 1,200 米的铺装跑道。当达到时速 110 千米时，“巨人”拉杆离地，接着左右两架曳航机离陆，最后离地的是最前面的曳航机。然后它们以时速 130 千米、每秒 0.5 米的上升率缓缓爬升到 500 米高度，再慢慢加速到时速 170～200 千米，作水平飞行。在爬升时，3 架曳航机必须保持相同的上升角度，稍有不慎，突然增加的张力会扯断曳航索，在气流紊乱时，空中碰撞的危险性极大。
三驾马车准备起飞
载运 120 名士兵的运用试飞中。“巨人”右侧的助飞火箭在离地时没有点火，使“巨人”向右侧滑，引起 3 架曳航机的碰撞，“巨人” 和曳航机坠毁在跑道周边森林里，6 名机组乘员、120 名搭载士兵和 3 名曳航机驾驶员全部丧命，成为 1941 年最惨重的飞行事故。
尽管事故不断，但在首飞三个月后的 1941 年 6 月，德国空军还是组建了 Me 321 大型运输滑翔机联队。联队包括各装备 6 架“巨人”的 3 个滑翔机中队和各装备 12 架 Bf 110C 的 3 个曳航机中队。在这个联队向东线出动前，又改组为 4 个特别大型滑翔机中队，每个中队由 5 架“巨人”和 15 架 Bf 110C 组成，到 9 月各中队已处于实战状态。9 月中旬，第 1 特别中队配属到北方战区第 1 航空军在里加活动；第 22 特别中队配属中央战区第 2 航空军驻扎在奥尔沙；第 4 特别中队配属给南方战区第 4 航空军开始驻扎刻赤，后驻第聂伯罗彼得洛夫斯克；留下的第 20 特别中队和联队本部也配给第 2 航空军。
Me 321 W2+SH 在奥尔沙准备起飞
为从欧洲西海岸入侵英国本土而研制的 Me 321 和它的三驾马车曳航方式在俄罗斯严寒条件下使用困难重重。首先这种曳航方式的航程只有 400 千米，在这个范围内要寻找具备 1,200 米铺装跑道的机场，还要准备保证“巨人”运用的必要器材设备，如大型牵引车、离陆车轮及装备器材、助飞火箭燃料贮藏和灌装设备……而由于 He 111Z 的研发迟迟没有到位，在东线作战还只能用 3 机曳航方式，充满危险。9 月 12 日第 1 中队向爱沙尼亚西方里加湾的萨列马运去突击部队，此后又为这个岛上的陆军和第 54 战斗航空团的 Bf 109 补给燃料和弹药。第 22 中队在恰达洛沃卡方面、第 4 中队在基辅. 罗斯托夫战线也都进行过几次补给行动。由于严寒使机场条件恶化，“巨人”陷于瘫痪。在 1941 年底 Me 321 大型运输滑翔机联队被撤消建制，但各独立的中队还残留在战场上。
1942 年初，为进行攻占马耳他岛的“大力神”作战，德军计划抽调东线的 Me 321，由 He 111Z 曳航运送两个的空降师（其中一个为意大利师）作战 。但“大力神”作战一拖再拖，最后取消。德军又打算把 Me 321 用于东线的攻击阿斯特拉罕和巴库油田的作战。以后东线战局急转，Me 321 的角色由攻击转为救急。如 1943 年初向斯大林格勒的被围德军紧急空运补给；此后又在克里米亚战线向孤立的库班桥头堡运送弹药……1943 年夏，德军企图用 Me 321 把集结在法国伊斯特勒的两个师运往西西里岛，但由于 He 111Z 曳航机的航程不够而终止。
Me 321 在 1941 年生产了 186 架，加上翌年生产的 14 架，共生产 200 架。它虽具备惊人的 22 吨载运能力，却由于自身没有动力而限制了它的实用。
给“巨人”装上动力
鉴于 Me 321 在实用试飞的经验教训，德国航空部决定给 Me 321 装上发动机，使它具备一定的机动能力以扩大其实用范围。在 1941 年 3 月就指令梅塞史米特公司进行这项发展。有两个方案：1、 重载时以三驾马车方式曳航加上助飞火箭起飞，到巡航高度脱离曳航机自力飞往目的地降落的、装备 4 台发动机的 Me 321C 型（大型动力滑翔机）；2、装备 6 台发动机、能像一般运输机自行起飞降落的 Me 321D 型。适用的 1,000 马力发动机有：BMW 801、BMW 132R、尤莫 211 和格罗姆-罗纳 14N 等，由于德制发动机要优先满足一线军用机的需要，最后选中 14 气缸的法制格罗姆-罗纳 14N 星形气冷发动机。
当时在法国梅利尼亚格的 SNCASO 工厂为德国空军生产的 200 架布罗克 175 双发攻击机接近完工。准备给它们装用的格罗姆-罗纳 14N 48/49 发动机、肖奥维埃尔可变距三叶螺旋桨、发动机整流罩及配件被全部征用运往德国。带动力的 Me 321 后改称为 Me 323，使用 Me 321B 的机体，试制了两架原型机：4 发的原型 1 号机和 6 发的原型 2 号机。两机都保留 Me 321 的基本构造，但中翼段的翼梁加强并向前延伸出发动机支架。格罗姆-罗纳 14N 的起飞功率 1,140 马力，在 5,000 米高度时功率为 1,035 马力。Me 323 在右翼装向左旋转的格罗姆-罗纳 14N-48 型，左翼装向右旋转的 49 型（布罗克 175 的装用法相反）。为了协调发动机，Me 323 左右两侧各配备一名航空机械士，其座位设在中央发动机外侧主翼前缘，因此乘员由 Me 321B 的 6 名增至 8 名。燃油箱设在货舱的背部，中翼主梁内有 4 个，主梁后位置有两个。起落装置为从货舱地板向两侧伸出的、各带两个前轮和三个主轮的条形架，像坦克一样各轮均独立悬挂，以适应在不平整的地面起降。